利用10x Genomics Chromium微流控系统，，实现通过序列标签区别不同细胞和转录本。。。。微流控系统通道直径很小一次通过一个细胞。。。首先在通道中加入带有标签的凝胶微珠，，单个细胞和单个带有标签的凝胶微珠结合，，，二者被加入的油包裹到一个液滴中，，，，形成油包水体系。。。。凝胶微珠上带有大量包含凝胶微珠特异性Barcode序列、、、分子特异性UMI序列和polyT序列的引物序列，，，，将细胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕获，，，，扩增后形成携带有Barcode和UMI序列的cDNA，，，即可实现将不同细胞来源的不同mRNA分子加上标签。。。
Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，，，，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列（如下图）。。。。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，，，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，，，，用于捕获有ployA尾的转录本。。。。
对制备好的单细胞悬液先进行质检，，，，质检合格后与Gel Beads和油分别加入到Chromium Chip G的不同通道，，经由微流体“T字”交叉系统形成GEM。。。。接着细胞裂解，，，，Gel Beads自动溶解释放大量引物序列，，，与带有PolyA的mRNA进行逆转录，，，生成带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。。
样本起始量与送样建议
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组织类型 |
新鲜组织、、、新鲜悬液或速冻组织 |
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细胞大小 |
＜40 μm |
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细胞活性 |
>85%（尽量去除细胞团/碎片/杂质等） |
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细胞浓度 |
700~1200 cells/μL |
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细胞总量 |
＞5万 |
注意事项：详细样本准备指南，，请联系在线客服。。
生物信息学分析内容
代表性文章
【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、、曼谷朱拉蓬研究所、、、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，，，，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、、、、SMART-seq）、、、、流式分选
研究背景
肝细胞癌（HCC，，，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，，hepatic cancer stem cells）的存在。。。。 由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，，这在定义靶向疗法时构成了挑战。。。。 研究人员在单细胞水平（10X Chromium、、、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。。。结果表明，，，，CSC在单细胞水平上的表型、、、功能和转录均存在异质性性，，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。。而且有趣的是，，，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，，，，并且彼此相互独立，，，，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。。
文章结果
大量数据表明CD13、、、、CD24、、、CD44、、、CD90、、、CD133、、、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，，，，研究人员选择CD24、、CD133、、、、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，，，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。。免疫荧光染色表明，，，，在两种细胞培养形态下（单层培养、、、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。。。
HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数分别是1343、、、1134）正常培养和缺氧培养（促进细胞干性）2周后，，研究人员依照三种表面标志物（CD24、、CD133、、、、EpCAM）分选细胞，，HuH1和HuH7中标志物阳性的CSCs比例分别为15-20%、、8-12%，，，，而标志物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），，培养后不同细胞亚群的自我更新能力差异很大（下图C-D）； 分选后的细胞经过1个月培养后，，，，和未分的得细胞相比，，，CD133+、、、、EpCAM+、、CD24+、、、Triple+细胞能够扩大成为混合CSCs，，而存活下的Triple-细胞能够扩大成混合CSCs，，，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，，，或者标记阴性细胞经历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。。
研究人员采用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、、、、10细胞混合测序、、100细胞混合测序）信息，，，，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、、、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了比较，，，，发现不同细胞类群具有不同的基因表达模式，，且不同类型细胞中每个细胞的基因表达模式均存在差异，，HuH7细胞间差异大于HuH1；当细胞混合（10细胞混合、、、、100细胞混合）后这种差异程度明显降低（下图A）。。。。而当单独聚类HuH7细胞时，，，发现不同标记细胞彼此可以区分（下图B）。。。。以上数据均表明单细胞水平上转录组存在异质性。。。。
研究人员比较了HuH7阳性标记细胞（Triple+）和阴性标记细胞（Triple-）基因表达差异，，鉴定到的286个Triple+相关基因可以预测来自LCI队列的240例肿瘤样本、、、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生存率，，但在非肿瘤样本中无意义。。
不同标记CSC细胞群体基因表达比较分析，，，，EpCAM+、、CD133+、、、CD24+、、、、Triple+特征基因基本不重合（下图A），，IPA通路分析也表明不同细胞群体的通路也不重合（下图C-F），，，，而且不同细胞群体特征基因可以用于生存期预测，，，，且EpCAM+、、、、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。。。
为了整体了解细胞群体多样性，，，，研究人员采用10X 单细胞测序方式，，，对3847个HuH1、、、、HuH7、、、P1细胞进行了分析，， HuH1可以分为2个亚群，，，，HuH7分为4个细胞亚群，，，P1分为3个细胞亚群，，，细胞聚类结果与与SMART-seq结果类似（下图A）。。。CSC标志物，，，，例如EpCAM、、CD133 (PROM1)、、、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，，，，AFP、、、、MDK、、、GPC3、、、GOLM1、、、、YY1AP1、、、PLK1, ECT2、、、NELFE（下图C）在不同细胞亚群中表达存在异质性。。P1的3个细胞亚群中表达了山中因子 (KLF4、、、、POU5F1、、、、MYC)，，，， 干细胞marker (NANOG)，，，，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，，，但其表达也存在异质性，，，，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（分别表达T细胞marker和B细胞marker），，第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）。。
参考文献
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
结果展示
1. 单细胞亚群分类
针对PCA结果中选取前10个主成分，，，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。。使用相同的数据进行t-SNE分析，，，，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。。。
2. Marker基因分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图
3. 差异基因KEGG富集性分析
Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，，，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本，，，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本。。。。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。。。。下图仅为报告中的展示图片
常见问题（FAQ）
1、、单细胞转录组测序需要做重复吗？？？
单细胞测序的目的在于鉴定细胞群体中的不同亚群、、得到新的重要分子标志物和鉴定稀有细胞亚群等，，，，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。。从目前已有的文献看，，对重复数没有强制要求。。。但从近期的发文趋势来看，，建议每组设置样本数3~5 个，，临床样本根据实际情况建议每组 5 例以上。。。。
2、、、组织样本如何制备单细胞悬液？？？？
单细胞转录组测序目前没有一个统一的样本制备方法，，针对于不同的组织样本，，有不同类型的样本单细胞制备方法。。此外，，，，可以具体根据老师提供的具体样本类型，，查阅相关的文献，，探讨适合于老师样本的单细胞悬液制备方法。。。。
3、、、单细胞转录组每个细胞能捕获到多少个基因？？
根据不同的细胞类型，，捕获到的基因数会有区别，，，，有些细胞类型高的会在3000左右，，，而有些大概在1000左右。。基因检出数与样本状态有关，，，不同类型的样本，，基因检出数可能存在数倍的差异。。。。
