单细胞转录组测序介绍

单细胞转录组测序（Single cell RNA sequencing），，简单来说，
，
，，就是在单个细胞水平上
，，，，对转录组水平进行测序分析的技术。。传统测序方法通常在多细胞基础上进行，，得到的是一堆细胞中信号的均值，，丧失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。。而单细胞测序技术能够揭示单个细胞的基因表达状态，
，
，解决了传统测序无法解决的细胞异质性问题。
。。。

这项技术自2009年首次问世以来，，
，持续不断地发展。。近年来，，，单细胞测序经历了爆发式的发展和普及。。。
。它在肿瘤、、发育生物学、、、、微生物学、、、神经科学等领域发挥着重要作用，，，成为生命科学研究的焦点。。。单细胞转录组测序技术的不断发展将在精准治疗、、、生物医学研究和临床应用中发挥越来越重要的作用
。。。
。单细胞测序技术正在推动生物学领域向前发展，，，，为个性化预防和治疗提供了技术支持。。。。

肿瘤研究：单细胞测序技术帮助揭示肿瘤内不同细胞类型的异质性，
，，探索肿瘤微环境中细胞的转录组表达和免疫功能。。
。
发育生物学：通过单细胞测序
，
，，，我们可以追踪胚胎发育过程中不同细胞的基因表达变化，，
，，理解细胞分化和发育。。。
神经科学：研究单个神经元的转录组可以帮助我们理解神经系统的功能、
、、神经退行性疾病以及神经元之间的相互作用。。
。
免疫学：单细胞测序技术有助于研究免疫细胞的异质性，，，
，例如T细胞、
、
、B细胞和巨噬细胞的功能状态。
。。
微生物学：通过单细胞测序，，
，，我们可以深入了解微生物群落中不同细菌
、、
、病毒和其他微生物的基因表达。
。。。



10x 3’单细胞
 

生物信息学分析内容



代表性文章

案例展示

Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期
：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所
、、
、曼谷朱拉蓬研究所、、、、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型
：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、
、SMART-seq）
、
、、、流式分选
 

研究背景

肝细胞癌（HCC，，，，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，
，，，hepatic cancer stem cells）的存在。。 由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，，这在定义靶向疗法时构成了挑战。
。 研究人员在单细胞水平（10X Chromium、、
、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。。。结果表明，
，CSC在单细胞水平上的表型、、功能和转录均存在异质性性
，，，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。。。而且有趣的是
，，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关
，，，，并且彼此相互独立，，，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。。

文章结果

大量数据表明CD13、
、CD24
、、CD44、
、
、、CD90、、、CD133、、
、、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，，，研究人员选择CD24
、、
、、CD133、
、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。。。
。免疫荧光染色表明，，，，在两种细胞培养形态下（单层培养、、
、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。。
。
 

HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数分别是1343
、、、
、1134）正常培养和缺氧培养（促进细胞干性）2周后，，，，研究人员依照三种表面标志物（CD24、、CD133、
、、EpCAM）分选细胞，，，HuH1和HuH7中标志物阳性的CSCs比例分别为15-20%、、、8-12%
，，，，而标志物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），，，培养后不同细胞亚群的自我更新能力差异很大（下图C-D）； 分选后的细胞经过1个月培养后，，，，和未分的得细胞相比，，CD133+、、
、、EpCAM+、、CD24+、、、Triple+细胞能够扩大成为混合CSCs，，而存活下的Triple-细胞能够扩大成混合CSCs，，，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，，
，或者标记阴性细胞经历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。。。。
 

研究人员采用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、、、10细胞混合测序、、、100细胞混合测序）信息，，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、、、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了比较，，发现不同细胞类群具有不同的基因表达模式，，
，，且不同类型细胞中每个细胞的基因表达模式均存在差异
，，，，HuH7细胞间差异大于HuH1；当细胞混合（10细胞混合、、、、100细胞混合）后这种差异程度明显降低（下图A）
。。。。而当单独聚类HuH7细胞时，
，，，发现不同标记细胞彼此可以区分（下图B）。。。以上数据均表明单细胞水平上转录组存在异质性。。
。
 

研究人员比较了HuH7阳性标记细胞（Triple+）和阴性标记细胞（Triple-）基因表达差异，，，鉴定到的286个Triple+相关基因可以预测来自LCI队列的240例肿瘤样本
、、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生存率
，
，，但在非肿瘤样本中无意义。。
 

不同标记CSC细胞群体基因表达比较分析，，，EpCAM+
、、、、CD133+、、、、CD24+、
、、、Triple+特征基因基本不重合（下图A）
，，，，IPA通路分析也表明不同细胞群体的通路也不重合（下图C-F），，，而且不同细胞群体特征基因可以用于生存期预测，，
，，且EpCAM+
、、、、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。。
 

为了整体了解细胞群体多样性，，，
，研究人员采用10X 单细胞测序方式，，，对3847个HuH1、、
、HuH7、、P1细胞进行了分析，
，
，， HuH1可以分为2个亚群，
，HuH7分为4个细胞亚群
，，，
，P1分为3个细胞亚群，，细胞聚类结果与与SMART-seq结果类似（下图A）。。。CSC标志物，，例如EpCAM、、CD133 (PROM1)、、、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，
，AFP、、
、、MDK
、、、GPC3、
、GOLM1、
、
、YY1AP1、
、PLK1, ECT2、、、NELFE（下图C）在不同细胞亚群中表达存在异质性
。。。P1的3个细胞亚群中表达了山中因子 (KLF4
、、
、POU5F1、、、
、MYC)，，，， 干细胞marker (NANOG)，，
，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，，，，但其表达也存在异质性，，，，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（分别表达T细胞marker和B细胞marker），，第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）
。。。
 

 

参考文献

Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
 

结果展示

1. 单细胞亚群分类

针对PCA结果中选取前10个主成分，，，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。。。。使用相同的数据进行t-SNE分析，，，，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。。
。
 

2. Marker基因分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图
 

3. 差异基因KEGG富集性分析

Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，，，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本
，，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本
。
。
。。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。
。下图仅为报告中的展示图片
 

 

常见问题（FAQ）

SeekOneDD 3’单细胞
 

 

BD 3’单细胞
 

 

 

10x 5’单细胞及免疫组库
 

案例展示

单细胞测序揭示复杂的肿瘤微环境
 

研究背景

了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型
，，，，对了解癌症进展和免疫疗法的机制是必不可少的。。
。本研究从8名乳腺癌患者的肿瘤样本及配对的正常血液、、乳腺和淋巴结样本中获得多个免疫细胞，
，开展单细胞RNA测序实验。
。。之后，，
，利用SEQC流程和“Biscuit”算法
，，对这些组织中的免疫细胞进行聚类和鉴定。。

研究思路

本研究总共鉴定出83个不同的免疫细胞簇，
，包括38个T细胞簇、、、27个骨髓谱系细胞簇、
、9个B细胞簇和9个自然杀伤细胞簇。。。。大多数的细胞簇（除了其中的10个）是不止一名患者所共有的，，尽管在肿瘤样本中的表型往往不同。。。研究指出，
，部分T细胞在肿瘤和正常组织中都存在，，不过细胞毒性T细胞在肿瘤中更丰富，，，Treg细胞也是如此。。
在一系列后续实验中，，，，研究人员利用10X Genomics的方法获得27,000多个T细胞的TCR-seq和RNA-seq配对数据并开展分析。。。比较了正常组织和乳腺癌组织的免疫组库
，，，，发现表型扩增往往发生在乳腺癌微环境中
。
。

这些观察结果，，，，以及免疫细胞的RNA-seq和TCR-seq数据集和全面的分析平台，，将有助于研究人员更好地了解免疫细胞促进和延缓肿瘤生长背后的分子机制。。。
 

 

参考文献

ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060
 

结果展示

 

10x 单细胞ATAC-seq
 

案例展示

联合不同单细胞分析技术绘制人类造血系统分化的连续调节谱

研究背景

造血分化 是从造血干细胞分化为具有不同功能的细胞过程，，，
，在成人中主要发生在骨髓，，，，最终产生淋巴系细胞（B,T,NK cell）,髓系-粒系（monocyte, granulocyte），
，，，红系（Ery,mega）等细胞类型
，，，，是研究干细胞分化、、、、肿瘤免疫、、、血液疾病等的良好模型
。。造血分化过程是一个复杂
、、多阶段的，，
，受多种因子调控的过程，，
，单细胞表观基因组分析有助于解析造血干细胞转录和细胞命运异质性的顺式和反式调节机制。。。
。

研究思路

首先利用scATAC-seq数据从chromatin accessibility入手，
，，分析造血分化过程染色质开放状态图谱的异质性
；用ChromVAR R包预测TF的活动；采用多种聚类方法，，，，如通过TF Z scores利用Hierarchical clustering 和t-SNE聚类，，
，，并采用了reference guided approach，，，
，基于bulk sample和算法对单细胞数据进行降维聚类分析；整合scRNA-seq 和scATAC-seq数据分析TF与chromatin accessibility，
，以及顺式调控元件和邻近基因的表达的相互关系。。。。

研究结果

研究人员通过单细胞ATAC-Seq的研究策略，，，分析了10类已定义的人类造血系统分化细胞类型中染色质可接近性的数据，，，构建造血细胞分化中染色质可接近性状态的变化轨迹
；并整合单细胞转录组数据，
，，，构建了转录因子动态调控轨迹。。。。
 

 

从单细胞RNA-seq和ATAC-seq的整合分析提供了对人类造血功能的调节特征和动态的见解
，，
，，在实验或计算上整合多种单细胞数据类型的进一步改进将为发育或疾病细胞命运决策提供单细胞水平上的视角。。期望未来的工作结合单细胞表观基因组学、、转录组学、、蛋白质组学和谱系测量可以揭示对启动调节多种细胞命运转换的调节因子的分子机制和时间顺序的重要见解。。

 

参考文献

Buenrostro J D , Corces M R , Lareau C A . Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.[J]. Cell, 2018.
 

结果展示